Las tinciones hematológicas constituyen una serie de métodos utilizados para la coloración de las estructuras que componen las células de la sangre y la médula ósea. Tienen por objetivo aumentar el contraste entre las estructuras celulares y el medio que las rodea, y permiten que las distintas células sean identificadas al microscopio con mayor facilidad.
El primero en utilizarlas para visualizar el tejido sanguíneo fue Paul Ehrlich en 1879 que utilizaba una mezcla de colorantes ácidos y básicos (fucsina y azul de metileno), luego en 1891 Ernst Malachowski y Dmitry Leonidovich Romanowsky ensayaron diversas técnicas mezclando eosina y azul de metileno modificado (tinción de Malachowski-Romanowsky-Giemsa), ésta última es la ténica precursora de la tinción de May Grünwald-Giemsa utilizada actualmente en extendidos de sangre y médula ósea.
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| Paul Ehrlich |
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| Ernst Malachowski |
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| Dmitry Leonidovich Romanowsky |
Desde su origen hasta la actualidad se han generado varios métodos diferentes para facilitar la identificación de distintos elementos celulares. Muchos de ellos han caído en desuso por el avance de las nuevas tecnologías, pero algunos persisten y son útiles para la evaluación inicial de muestras obtenidas de pacientes. Los que actualmente se utilizan con mayor frecuencia son:
- la tinción de May Grünwald-Giemsa,
- la tinción con azul brillante de cresilo, y
- la tinción de Perls.
Tinción de May Grünwald-Giemsa
Para ésta técnica se utilizan las siguientes soluciones:
- La solución de May-Grünwald, que contiene eosina (como colorante aniónico) y azul de metileno (como colorante catiónico) disueltos en metanol.
- La solución de Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y productos de la oxidación del azul de metileno (azur A, azur B, violeta de metilo y azul de metilo).
Existen dos procesos de tinción, el clásico y la técnica rápida.
En el clásico el proceso consta de los siguientes pasos:
- Comprobar que el extendido se encuentre seco.
- Colocar varias gotas de la solución de May Grünwald cubriendo todo el preparado y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos. Si se te ha terminado la solución de May Grünwald la puedes reemplazar por alcohol medicinal obteniendo un resultado similar.
- Lavar con abundante agua estabilizada (agua destilada con pH de 7) eliminando toda la solución anterior, y dejar el preparado bien cubierto de agua durante 1 minuto.
- Colocar aproximadamente 12 gotas de Giemsa sobre el extendido cubierto de agua se puede soplar sobre el extendido para homogeneizar. Dejar actuar la solución durante 10 ó 15 minutos.
- Lavar con abundante agua removiendo el colorante remanente y luego dejar secar.
- Si se observan muchas sales precipitadas en el preparado, se puede realizar un lavado rápido con alcohol (con el preparado en posición casi vertical, dejar caer alcohol sobre el mismo y luego inmediatamente lavar bien con agua)
El resultado será el siguiente:
En la técnica rápida se disminuyen los tiempos, con resultados similares en la tinción, de la siguiente manera: Exposición a la solución de May Grünwald 1 minutos, lavar con agua y dejar cubierto de agua durante 1 minuto, exponer a la solución de Giemsa durante 5 minutos, lavar y dejar secar.
Tinción con azul brillante de cresilo
Esta tinción es utilizada para la identificación de reticulocitos, hemoglobina H y otras formas inestables de hemoglobina.
La solución de azul brillante de cresilo se compone de azul de metileno, cloruro sódico y oxalato potásico.
La técnica es la siguiente:
- Colocar en un tubo de ensayo 2 gotas de sangre y 2 gotas de la solución colorante y mezclar.
- Incubar a 37 ºC manteniendo tapado el tubo para evitar la evaporación.
- Realizar frotis de la mezcla a los 15 ó 30 minutos de incubación.
- Secar al aire.
- Colocar una gota de resina sintética y un cubreobjetos.
Cuando se realiza el conteo hay que tener cuidado de no confundir reticulocitos (células recuadradas en rojo) con elementos de la serie blanca (células con granulaciones pero no citoplasma de color azul)
Se realizará el recuento de reticulocitos en 10 campos de 100x de aumento (hay aproximadamente 100 hematíes/campo) y luego se realizará la siguiente fórmula:
Porcentaje de reticulocitos = nro de reticulocitos x 100
1000 (GR que hay en 10 campos)
Tinción de Perls
Esta tinción es utilizada para identificar en los extendidos del material aspiro de médula ósea la presencia de hemosiderina.
Para realizar la tinción es necesario ferrocianuro de potasio al 4%, ácido clorhídrico al 4%, colorante rojo rápido nuclear y formol.
La técnica de tinción es la siguiente:
- Preparación solución de Perls: colocar en un vaso de precipitado: 25 ml de ferrocianuro de potasio y 25ml de HCl al 4% (debe prepararse la solución al momento de usar, es una solución muy tóxica, venenosa)
- Fijar los frotis con formol por 5 minutos (aproximadamente de 6 a 8 gotas) o metanol.
- Dejar secar al aire.
- Vaciar la mezcla de Perls precalentada a 56 ºC en un vaso de Copplin, inmediatamente colocar los frotis (previamente fijados) y tapar.
- Incubar por 30 minutos.
- Lavar con agua de la canilla.
- Dejar secar al aire.
- Contrateñir con solución de rojo rápido nuclear por 5 minutos. También se puede contrateñir con hematoxilina-eosina.
- Lavar con agua de la canilla.
- Secar al aire.
- Cubrir con resina sintética y un cubreobjetos.
Los depósitos de hemosiderina se observarán teñidos de tono azulado, hay que cuidarlo de no confundirlos con los granulocitos eosinófilos.
Curiosidades para los lectores
Tinción de May Grünwald-Giemsa (español)
May Grünwald-Giemsa's stain (inglés)
Pappenheim-Färbung (alemán)
Coloration de May-Grünwald Giemsa (francés)
Metodo di May-Grunwald e Giemsa (italiano)
Método de May-Grunwald-Giemsa (portugués)
